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影響電泳分離的主要因素

來源:原創 編輯:admin 時間:2016-11-18 12:45
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影響電泳分離的主要因素

2016-07-29 
 

1. 待分離生物大分子的性質:待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質都會對電泳有明顯影響。一般來說,子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形,則其電泳遷移速度越快。

 

2. 緩衝液的性質:緩衝液的pH值會影響待分離生物大分子的解離程度,從而對其帶電性質產生影響,溶液pH值距離其等電點愈遠,其所帶淨電荷量就越大,電泳的速度也就越大,尤其對於蛋白質等兩性分子,緩衝液pH還會影響到其電泳方向,當緩衝液pH大於蛋白質分子的等電點,蛋白質分子帶負電荷,其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩衝液pH值的穩定性,緩衝液通常要保持一定的離子強度,一般在0.02-0.2,離子強度過低,則緩衝能力差,但如果離子強度過高,會在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層(即離子氛),由於離子氛與待分離分子的移動方向相反,它們之間產生了靜電引力,因而引起電泳速度降低。另外緩衝液的粘度也會對電泳速度產生影響。

 

3. 電場強度:電場強度(V/cm)是每厘米的電位降,也稱電位梯度。電場強度越大,電泳速度越快。但增大電場強度會引起通過介質的電流強度增大,而造成電泳過程產生的熱量增大。電流在介質中所做的功(W)為:W=I.R.t式中:I為電流強度,R為電阻,t為電泳時間。

電流所作的功絕大部分都轉換為熱,因而引起介質溫度升高,這會造成很多影響:

1)樣品和緩衝離子擴散速度增加,引起樣品分離帶的加寬;

2)產生對流,引起待分離物的混合;

3)如果樣品對熱敏感,會引起蛋白變性;

4)引起介質粘度降低、電阻下降等等。電泳中產生的熱通常是由中心向外周散發的,所以介質中心溫度一般要高於外周,尤其是管狀電泳,由此引起中央部分介質相對於外周部分粘度下降,摩擦係數減小,電泳遷移速度增大,由於中央部分的電泳速度比邊緣快,所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度,可以減小生熱,但會延長電泳時間,引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度,同時可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。

 

4. 電滲:液體在電場中,對於固體支持介質的相對移動,稱為電滲現象。由於支持介質表麵可能會存在一些帶電基團,如濾紙表麵通常有一些羧基,瓊脂可能會含有一些硫酸基,而玻璃表麵通常有Si-OH基團等等。這些基團電離後會使支持介質表麵帶電,吸附一些帶相反電荷的離子,在電場的作用下向電極方向移動,形成介質表麵溶液的流動,這種現象就是電滲。在pH值高於3時,玻璃表麵帶負電,吸附溶液中的正電離子,引起玻璃表麵附近溶液層帶正電,在電場的作用下,向負極遷移,帶動電極液產生向負極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同,則加快電泳速度;如果相反,則降低電泳速度。

 

5. 支持介質的篩孔:支持介質的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快,反之,則泳動速度慢。

 

關於膠回收切膠的一點注意事項:

 

1. 電泳的buffer和gel都是新製的,切膠的台子清理幹淨,刀片最好洗淨滅菌,總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA汙染。

 

2. 切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積,可以用相對比較薄的膠來做,隻要夠點樣即可,也可采用薄而寬的梳子來跑膠。

 

3. 關於防護,在一般有機玻璃後就足夠了,戴上防護麵具以保護眼睛,如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射,或者對於膠有特殊要求,例如要求不含EB,可以采用點marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進行切膠。

 

4. 按照正常程序點marker跑膠,然後切下有marker的膠,EB染色,紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由於要回收的帶與marker間的相對位置已知,根據尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷,可以直接在marker邊點少量的樣,這樣位置就容易確定了。

 

 

影響電泳實驗結果的其它一些因素:

瓊脂糖:不同廠家,不同批號的瓊脂糖,其雜質含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強度,應有選擇地使用。

 

凝膠的製備:凝膠中所加緩衝液應與電泳槽中的相一致,溶化的凝膠應及時倒入板中,避免倒入前凝固結塊.倒入板中的凝膠應避免出現氣泡,以免影響電泳結果。

 

電泳緩衝液:為保持電泳所需的離子強度和pH,應經常更新電泳緩衝液。

 

樣品加入量:一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量,加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定。當加樣孔大時,樣品上樣量應相應加大,否則會造成條帶淺甚至辨認不清;反之則應適當減少加樣量,但是上樣量過多會造成加樣孔超載,從而導致拖尾或彌散,對於較大的DNA此現象更明顯。

DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率,平行對照樣品應使用同樣的緩衝條件以消除這種影響。

DNA遷移率取決於瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小.采用不同濃度的凝膠有可能分辯範圍廣泛的DNA分子,製備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的範圍來決定凝膠的濃度.小片段DNA的檢測應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,以提高分辨率。

 

 

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